Интерпретация анализа крови кошек

Интерпретация анализа крови кошек

The Veterinary Journal

Available online 1 May 2014

 

  • Center for Companion Animal Health, School of Veterinary Medicine, University of California, USA

Краткое содержание статьи

Этот обзор касается того, что удалось узнать о диагностике и лечении  инфекционного перитонита  кошек (FIP) с момента публикации последнего расширенного обзора литературы с 1963 по 2009 гг. Хотя в этих областях есть прогресс, получение окончательного диагноза FIP остается проблемой для тех ветеринаров и /или владельцев кошек, которым нужна абсолютная определенность. Этот обзор будет рассматривать непрямые и прямые диагностические тесты и будет подчеркивать их ограничения, также как их специфичность и чувствительность. Пока не имеется эффективного лечения инфекционного перитонита  кошек,   хотя имеются как утверждения, что такие методы существуют, так и проблески надежды, исходя из новых методов лечения, которые находятся в процессе исследования.  Инфекционный перитонит  кошек также выявлен у диких кощачьих и заболевание, подобное FIP, является сейчас растущей проблемой среди домашних хорьков.

Введение

Инфекционный перитонит кошек (FIP) является коронавирусным заболеванием, которое может поражать кошек любого возраста, но наиболее часто встречается среди кошек < 3 лет возраста и особенно от 4 до 16 недель возраста (Pedersen, 2009). FIP встречается, главным образом, в питомниках (племенные кошки), приютах и местах с высокой плотностью содержания кошек. Что типично для энзоотической инфекции, заболеваемость FIP может широко варьировать в течение времени. Смертность крайне высока после появления клинических симптомов, хотя некоторые кошки могут жить с этим заболеванием в течение недель, месяцев или, редко, лет. Детальное клиническое описание FIP может быть найдено в более ранных полных обзорах и не будет рассматриваться в этой статье (Addie et al., 2009; Pedersen, 2009; Drechsler et al., 2011).

 

Вирус  инфекционного перитонита кошек (FIPV) возникает вследствие специфических мутаций часто встречающегося коронавирусного энтерита кошек (FECV), который является повсеместно встречающимся во всем мире и сам по себе не является важным патогеном (Pedersen, 2009). FECV распостраняется через фекалии большинства очевидно здоровых кошек в местах большого скопления кошек (Pedersen et al., 2004) и передается через прямое потребление фекалий или зараженной подстилки и других предметов, бывших в контакте с вирусом. Котята обычно становятся инфицированными в возрасте около 9 недель (Pedersen et al., 2004 и  Pedersen et al., 2008). Мутанты FECV, способные вызывать инфекционный перитонит кошек, вероятно, генерируются в больших количествах в течение этого начального периода инфекции, когда уровни репликации FECV экстремально высоки (Pedersen et al., 2008; Vogel et al., 2010).Однако, только у маленькой части кошек, имеющих эти мутантные вирусы, будет развиваться инфекционный перитонит кошек. Сопротивляемость FIP сложна и включает генетическую чувствительность, возраст на момент контакта с вирусом и количество стрессоров, которое наблюдается одновременно с инфекцией и имеет негативное влияние на способность инфицированных кошек элиминировать этот вирус.

 

Период времени между начальным контактом с FECV и появлением клинических симптомов заболевания может быть от 2-3 недель до нескольких месяцев или, редко, лет. Этот период может отражать время, необходимое для развития мутантного FIPV, или время, необходимое для прогрессирования заболевания от субклинического до клинического состояния. Субклиническая инфекция обычно ограничена брыжеечными лимфоузлами и может устраняться  или прогрессировать (Pedersen and Black, 1983; Legendre et al., 2004; Pedersen, 2009). Начало явного заболевания является сигналом о том, что борьба организма кошки с вирусом проиграна и выздоровление крайне маловероятно. Есть редкие случаи, когда кошка демонстрирует очевидное восстановление, но  клинические симптомы возвращаются через несколько месяцев или даже лет (Legendre and Bartges, 2009).

Продолжительность заболевания между появлением клинических симптомов и смертью также вариабельна, но обычно короче у более молодых кошек и кошек с выпотной формой, чем у более старых кошек и кошек с невыпотной формой заболевания. Некоторые кошки, даже с выпотной формой инфекционного перитонита кошек, могут жить в течение многих месяцев и автор работал с бирманской кошкой, которая умерла от сухой формы инфекционного перитонита кошек в возрасте 6 лет; на основании расширенного клинического анамнеза эта кошка, видимо, имела субклиническую форму заболевания на протяжении всей ее жизни. В одном исследовании, касающемся, главным образом, кошек с относительно слабыми симптомами невыпотной формы заболевания, уровень выживания в течение года наблюдался только у 5% кошек. 1

Владельцы, которые приобретают котенка или молодую кошку, часто становятся сильно привязанными к животному к моменту появления первых симптомов инфекционного перитонита кошек.  Диагноз инфекционного  перитонита кошек, особенно его крайне высокий уровень смертности и отсутствие какого — либо эффективного лечения, имеет сильный психологический эффект на многих владельцев.

Это также вызывает у владельцев, испытывающих наибольший страх, желание контактировать с заводчиками и руководителями питомников. Поскольку, некоторые кошки с FIP пока находятся в удовлетворительном состоянии ко времени постановки диагноза и могут часто жить в течение недель или месяцев только с симптоматическим лечением, владельцы могут неохотно принимать диагноз или тот факт, что не имеется эффективного лечения. Это может привести к проведению серии дополнительных тестов, которые часто претендуют на то, чтобы быть высокочувствительными и специфичными, но редко дают желаемый ответ и могут даже еще более осложнить постановку диагноза. Отсутствие эффективного лечения часто усложняет ситуацию, и некоторые владельцы будут интенсивно изучать заболевание по интернету и другим источникам. Это может привести их к людям, которые утверждают, что нашли лечение этого заболевания, которое либо излечит, либо продлит жизнь. Эти утверждения часто поддерживаются редкими сообщениями от владельцев, которые нашли такое лечение успешным. К сожалению, из-за проблем с интерпретацией доступных диагностических тестов, не все кошки с диагностированным FIP, на самом деле имеют это заболевание. Если эти кошки имеют самокупирующееся состояние, иное чем инфекционный перитонит кошек, они будут хорошо отвечать на любое безопасное лечение, которое было назначено. Такие случаи создают кредит доверия конкретному лечению, который оно не заслуживает.

 

Целью этого обзора является обновление информации о диагностике и терапии инфекционного перитонита кошек со времени проведения последнего такого обзора (Pedersen, 2009).Количество исследований на эту тему увеличилось за последние 5 лет и наши знания о FIP значительно расширились. Однако, до сих пор нет легкого способа предотврашения этого заболевания, нет простого способа точной диагностики его и нет эффективного способа лечения. Надеюсь, что это изменится с расширением наших знаний о факторах, вызывающих FIP и появлением препаратов, которые направлены на важные стадии репликации вируса FIP.

 

Диагностические тесты для инфекционного перитонита кошек

 

Диагноз инфекционного перитонита кошек основывается в первую очередь на рассмотрении возраста кошки, ее происхождения, клинических симптомов и физикального обследования. Кощки в возрасте 4-36 месяцев, находящиеся в окружении большого количества других кошек, которые демонстрируют стойкую, но волнообразную лихорадку, не отвечающую на антибиотики, должны в первую очередь подозреваться на наличие инфекционного перитонита кошек. Очень мало инфекционных заболеваний, иных чем инфекционный перитонит кошек, имеют такие проявленпя. Более специфические симптомы инфекционного перитонита кошек, наблюдаемые владельцами или выявлямые при физикальном обследовании, будут сужать диагностический выбор еще больше. Растяжение брюшной полости за счет асцита, диспное при плевральном выпоте, желтушность, гипербилирубинурия, заметные массы на почках и/или брыжеечных лимфузлах, увеит и ряд неврологических симптомов, ассоциированных с вовлечением головного или спинного мозга являются частыми у кошек с выпотной (влажной) или невыпотной (сухой) формами инфекционного перитонита кошек.

К этому моменту, диагноз инфекционного  перитонита кошек может быть поставлен с «достаточной достоверностью». Однако, учитывая высокую смертность, многи ветеринары и владельцы чувствуют себя некомфортно с диагнозом, базирующимся на «достаточной достоверности».

 

Трудностью затем становится выбор тестов, которые будут увеличивать вероятность того, что клинические симптомы вызваны FIP (непрямые тесты), или будут обеспечивать окончательный диагноз (прямые тесты). Важно помнить, что чувствительность и специфичность любого непрямого теста будет сильно варьировать, в зависимости от вероятности того, что кошка имеет инфекционный перитонит кошек, на основании других параметров. То есть, позитивная прогностическая ценность теста, такого как полный анализ крови или соотношение альбумин/глобулин для прогнозирования наличия инфекционного перитонита кошек будет значительно больше у кошек, которые имеют проявления, характерные для инфекционного перитонита кошек,  чем для кошек, которые имеют проявления, не типичные для FIP. Также важно помнить, что результаты дополнительных непрямых тестов также способны повести диагностический процесс в неправильном направлении, также как укрепить его.

 

Непрямые тесты

 

 Общий анализ крови, альбумин, глобулин и билирубин

 

  Диагноз инфекционный перитонит кошек обычно ставится после получения данных анамнеза, клинических данных, нарушений, выявленных при общих диагностических процедурах и, когда возможно, данных посмертного исследования и гистопатологии ( Sharif et al., 2010. Классические непрямые тесты на FIP включают общий анализ крови, общее количество сывороточного протеина, уровней альбумина и глобулина, соотношения альбумин/глобулин и биохимического анализа крови ( Addie et al., 2009; Pedersen, 2009; Drechsler et al., 2011). Частые отклонения включают хроническую нерегенеративную анемию (анемия хронического заболевания), лейкоцитоз с абсолютным увеличением количества нейтрофилов и абсолютное снижение количества лимфоцитов, увеличенное количество белка в сыворотке, ассоциированное с высоким уровнем глобулина и низким уровнем альбумина и низкое соотношение альбумин/глобулин.

 

Гипербилирубинемия и гипербилирубинурия часто встречаются у кошек с FIP, особенно у кошек с выпотной формой. Подьемы билирубина (или биливердина) в сыворотке и моче обычно не ассоциированы с подьемами уровней ферментов печени (Addie et al., 2009) и печень часто не поражается у кошек с FIP; доказательств холестаза не наблюдается. Поэтому, подьем билирубина в крови и моче наблюдается не вследствие заболевания печени, как ранее предполагалось, а, в большей степени, вследствие увеличенного разрушения эритроцитов как в области поражений, так и в общем русле циркуляции и вследствие трудностей очищения от продуктов распада эритроцитов. У кошек крайне слабо функционирует глюкуронидация (Court and Greenblatt, 2000), что ограничивает уровень метаболизации и восстановления билирубина и биливердина. Если эти частые нарушения дополняются обычными данными по полу, породе, возрасту и клиническими симптомами, диагноз инфекционный перитонит кошек может быть поставлен с высокой определенностью. Даже хотя многие кошки с FIP имеют характерные данные общего анализа крови, уровней альбумина и глобулина и соотношения альбумин/глобулин, нет причины ожидать, что каждый целевой параметр будет всегда изменен в типичном для FIP направлении. Более важна общая картина и всегда в контексте породы, пола, возраста, клинических и физикальных особенностей.

 

Анализ выпота

 

  Наличие жидкости характерного типа в перитонеальной полости или. Менее часто, в плевральной полости является одной из наиболее частых диагностических особенностей выпотной (влажной) формы инфекционного перитонита кошек. Влажный тип инфекционного перитонита кошек преобладает у большинства чистопородных и помесей кошек, за исключением бирманской и бурмезской, у которых более часто диагностируется сухая форма. Жидкость обычно имеет желтый оттенок, вследствие наличия билирубина и, редко, зеленоватый оттенок, вследствие наличия биливердина. Как и в случае с гипербилирубинемией и гипербилирубинурией, желтоватое окрашивание является продуктом микрогеморрагий и разрушения эритроцитов макрофагами.

Выпоты при FIP прозрачные до умеренной мутности, вискозные (консистенция яичного белка) и высоким содержанием белка (близко к содержанию в сыворотке или выше). Они часто формируют сгустки при помещении в пробирку.

 

Выпоты при FIP часто классифицируются как «модифицированный транссудат» на основании их ощутимо низкого количества клеток. Однако, они являются воспалительными экссудатами, если быть точными, и не удовлетворяют установленным физикальным или физиологическим критериям для модифицированного транссудата (Zoia et al., 2009). Большинство выпотов при FIP содержат малое количество клеток (500-5000/µL), включая макрофаги, нейтрофилы и небольшое количество лимфоцитов. Выпоты при FIP обычно не выглядят геморрагическими по внешнему виду, за исключением некоторых случаев плеврального выпота. Однако, они часто содержат микроскопические количества эритроцитов и видимые нити фибрина. Эксудат при FIP непохож на экссудат при бактериальном перитоните; жидкость, наблюдающаяся при бактериальном перитоните явно гнойная по виду, с очень высоким содержанием нейтрофилов и не является вискозной или желтовато — окрашенной. Транссудаты и модифицированные транссудаты, ассоциированные с заболеваниями печени и сердца, разрывом лимфатических протоков и неоплазией, не имеют тех же самых физикальных и клеточных характеристик, как выпоты при FIP.

 

Ультрасонография

 

Анализ асцитических или плевральных экссудатов у кошек с FIP зависит от возможности обнаружить наличие такого выпота и получить образец жидкости при помощи центеза. Большие количества плеврального или перитонеального выпота   часто вызывают заметное диспное или увеличение обьема живота. Однако, во многих случаях выпоты протекают бессимптомно во время первичного физикального обследования или имеют минимальный обьем. В этих случаях ультрасонография или рентгенография могут быть использованы для идентификации или подтверждения этих выпотов и помогают в сборе образцов. Рентгенография имеет более ограниченную ценность при абдоминальных выпотах, но может быть более чувствительна в выявлении малых количеств плевральных выпотов.

 

Хотя ультрасонография и рентгенография могут быть очень полезны в идентификации наличия жидкости, они не являются FIP-специфичными тестами. Ретроспективно возможности ультрасонографии оценивались у 16 кошек, у которых был подтвержден диагноз выпотной или невыпотной формы FIP (Lewis et al., 2010). Печень имела нормальную эхогенность у 11 (69%) кошек, была диффузно эхогенной у трех кошек, фокально гиперэхогенной у одной кошки и фокально гипоэхогенной у другой. Пять кошек имели гипоэхогенной подкапсулярное кольцо у одной или обоих почках. Свободная жидкость имелась в перитонеальной полости у 7 кошек и в ретроперитонеальном пространстве у одной кошки. Абдоминальная лимфаденопатия набладалась у 9 кошек. Селезенка была нормальной эхогенности у 14 кошек и была гипоэхогенная у двух. Одна кошка имела билатеральный орхит с потерей нормальной архитектуры семенников. Авторы заключили, что ни одна из этих ультрасонографических находок не была специфична для инфекционного перитонита кошек, такие находки, когда рассматриваются вместе с соответствующими клиническими симптомами, должны увеличивать уровень подозрения на инфекционный перитонит кошек.

 

Соотношение альбумин/глобулин и электрофорез сывороточных белков

 

 Соотношение альбумин/глобулин считается полезным   прогностическим показателем наличия инфекционного перитонита кошек. Однако, прогностическая ценность соотношения альбумин/глобулин сильно зависит от наличия других анамнестических, клинических/физикальных или лабораторных отклонений, ассоциированных с этим заболеванием. В исследовании случаев инфекционного перитонита кошек, наблюдаемых в практике специализированного центра, было сделано заключение, что когда частота заболеваемости инфекционного перитонита кошек является низкой, низкое соотношение альбумин/глобулина полезно для исключения FIP, но не полезно для постановки положительного диагноза на FIP (Jeffrey et al., 2012).

 

Увеличенное количество общего белка и/или глобулина часто наблюдается при исследовании биохимического анализа крови у кошек с FIP. В отсутствие других общих лабораторных нарушений иногда полезно анализировать эти белки при помощи электрофореза в геле для выявления точной причины их подьема. Taylor et al. (2010) выполнил ретроспективное исследование      результатов электорофореза всех сывороточных протеинов от кошек, обследованных в University Bristol Feline Centre, UK, с  2002-2009; 155 удовлетворяли критериям включения. Клинические случаи с окончательным диагнозом были классифицированы как имеющие нормальные или патологические электрофоретические паттерны сывороточных протеинов, которые были сравнены с данными 77 клинически нормальных кошек. Из 155 случаев, 136 (87.7%) имели нарушенные сывороточные электрофоретические профили, наиболее часто вследствие поликлонального увеличения гамма глобулинов. Наиболее частым заболеванием, ассоциированным с нарушениями сывороточных протеинов было инфекционное/воспалительное заболевание (80/136; 58.8%), включая 39 кошек с диагностированным FIP. Моноклональная гаммапатия наблюдалась у 4 кошек с FIP, у одной кошки с лимфомой и в двух случаях со спленической плазмацитомой.

 

Внутриглазные и неврологические симптомы

 

Большинство молодых кошек с внутриглазными или неврологическими заболеваниями имеют невыпотную форму инфекционного перитонита кошек (Pedersen, 2009). FIP с поражением глаз обычно проявляется увеитом, с идиопатическим увеитом в качестве одного из основных дифференциальных диагнозов. Wiggans et al. (2013) сравнивали два этих заболевания, особенно диагностическую ценность цитологии внутриглазной жидкости. Они обнаружили, что продолжительность заболевания имеет тенденцию быть более короткой у кошек с FIP, в сравнении с кошками с идиопатическим увеитом. У кошек с идиопатическим увеитом микробные нуклеиновые кислоты, антигены или антитела против причинного агента редко обнаруживавались в крови/сыворотке, в то время как титры к коронавирусу кошек ≥ 1:6400 выявлялись только у кошек с FIP. При цитологическом исследовании внутриглазной жидкости, количества плазматических клеток коррелировали с преципитатами в роговице и продолжительностью заболевания. Как ожидалось, клинически выявляемая гифема коррелировала с количеством эритроцитов, в то время как не было корреляции между количеством клеток в передней камере глаза и опалесценцией внутриглазной жидкости. Хотя внутриглазная жидкость содержала преимущественно нейтрофилы у кошек с FIP, а большие реактивные лимфоциты и плазматические клетки встречались более часто у кошек с идиопатическими увеитами, ни клиническая, ни цитологическая оценка содержания передней камеры глаза не различалась значительно между кошками с идиопатическим увеитом и FIP-ассоциированным увеитом.

 

Вовлечение головного мозга или головного мозга и спинного мозга при невыпотной форме FIP хорошо известно (Pedersen, 2009); однако вовлечение только спинного мозга менее   часто диагностируется. В другом обзоре случаев, Marioni-Henry (2010) нашел, что воспалительные/инфекционные заболевания и инфекционный перитонит кошек были наиболее часто встречаемыми причинами миелитов кошек, представляя примерно 50% всех случаев. Неоплазия была выявлена примерно в 25% случаев, при этом лимфосаркома была наиболее частой злокачественной опухолью спинного мозга у кошек. Инфекционный перитонит кошек и лимфосаркома имели тенденцию встречаться у более молодых кошек, в то время как спинальные заболевания у кошек >10 лет с большей вероятностью вызывались другими спинальными опухолями, заболеванием межпозвоночного диска или фибрознохрящевой эмболией.

 

Титры антител против коронавируса кошек

 

 По-прежнему существуют разногласия в отношении использования и интерпретации титров антител против коронаровироза кошек в сыворотке или плазме крови ( Pedersen, 2009). Основная проблема тестов на антитела заключается в том, что как FECV, так и FIPV, будучи практически идентичны друг другу, вызывают одинаковые реакции антител. Титры, как правило, высоки среди здоровых кошек в тех же условиях, которые способствовали появлению инфекционного перитонита кошек. Титры антител против коронавируса кошек, если точно выполнены, имеют, тем не менее, определенную ценность. Хотя многие здоровые кошки, имевшие контакт с FECV, имеют титры, выявленные при помощи непрямого иммунофлуоресцентного метода, от 1:100 до 1:400 (Pedersen et al., 2008), как и многие кошки с FIP, вероятность того, что титр ассоциирован с FIP, увеличивается с ростом величины титра. Мало здоровых кошек имеют титр 1:1600, в то время как титры ≥ 1:3200 с высокой вероятностью говорят о наличии инфекционного перитонита кошек (Hartmann et al., 2003). Здоровые кошки с титром < 1:100 нечасто выделяют FECV со своими фекалиями, в то время как кошки с титрами 1:400 обычно положительны на наличие коронавируса кошек в фекалиях (Pedersen et al., 2008).

 

Наличие низких титров коронавируса кошек у кошек с подтвержденным FIP всегда было проблемой. Meli et al. (2013) попытался обьяснить это несоответствие тем, что вирус в крови или выпотах таких кошек был связан антителами и, поэтому, снижались титры антител в сыворотке/плазме или выпотах. Тринадцать образцов выпотов, один образец плазмы и три неопределенных образца от кошек с FIP, которые имели неожиданно низкие титры коронавирусных антител в сыворотке, были исследованы при помощи (RT)- PCR в реальном времени. Увеличенные количества вируса коррелировали с низким уровнем сигналов в методе непрямой иммунофлуоресценции, ELISA и быстрых тестах на иммуномиграцию антител в 70% образцов. Тем не менее, пять сывороток или образцов выпотов с низкими титрами антител к коронавирусу кошек были негативны при выполнении RT-PCR в реальном времени, поэтому, наличие только наличие вируса не было единственным обьяснением ложноотрицательных результатов теста на наличие сывороточных коронавирусных антител.

 

Были попытки сделать тесты на антитела более специфичными для FIPV, также как были попытки сделать PCR-тесты более специфичными для FIPV. Классический тест, который пока есть в продаже, называется ‘7b’ тест на антитела. Этот тест был разработан на основании неверного предположения, что FECV не имеет ORF 7b ген и, поэтому, не продуцирует ORF 7b белковый продукт, в то время как FIPV имеет ген ORF 7b, продуцирует протеин и, следовательно, вызывает ответ антител на ORF 7b белок. Сейчас хорошо известно, что практически все полевые изоляты FIPV и FECV имеют интактный ген ORF 7b и, поэтому, оба вызывают образование анти — ORF 7b антител. Этот факт, поскольку он относится к 7b тесту на антитела, был повторно подтвержден Kennedy et al. (2008); 95 образцов сывороток, представленных для различных диагностических тестов, и 20 образцов от кошек, не имевших специфических патогенов (свободных от коронавирусной инфекции и антител) были протестированы на наличие антител против очищенного ORF 7b белка. Как и ожидалось, экспрессия ORF 7b белка была найдена у большинства инфицированных коронавирозом кошек (те FECV или FIPV) и было сделано заключение, что серопозитивность для этого белка не является специфичной для FIPV и не может быть использована для диагностирования инфекционного перитонита кошек В сущности, 7Б тест на антитела ничем не отличается от всех других тестов на антитела к коронавирозу кошек.

 

ELISA является популярным тестом для выявления антител при многих заболеваниях, но имеет и недостатки, в сравнении с непрямым иммунофлуоресцентным тестом на антитела. Takano and colleagues (2013a) разработали три новых иммунохроматографических метода с использованием рекомбинантного белка нуклеокапсида коронавируса кошек. Два из трех тестов вызывали беспокойство, за счет неспецифического связывания, в то время как третий метод,с использованием белка А, оказался равным по специфичности и чувствительности стандартному ELISA в выявлении антител в плазме, сыворотке, цельной крови и асцитической жидкости, в то время как, предположительно, был проще для выполнения.

 

Альфа 1 кислый гликопротеин (AGP)

 

  AGP широко используется, особенно в Европе, как тест -индикатор на наличие   инфекционного перитонита кошек. AGP был найден почти десять лет назад hyposialylated у кошек с FIP, но не у нормальных кошек или у кошек с другими патологиями ( Ceciliani et al, 2004).Это исследование подтвердило, что сывороточный AGP является сильным специфическим маркером для инфекционного перитонита кошек, но только вместе с другими факторами риска ( Paltrinieri et al., 2007). Байесовский подход продемонстрировал, что когда клиническая предсказуемость инфекционного перитонита кошек была высокой, на основании анамнеза и клинических симптомов, умеренные сывороточные уровни AGP (1.5-2 μg/mL) могли дифференцировать кошек с FIP от других. Однако, только высокие сывороточные уровни AGP (> 3 μg/mL) были высокочувствительными для инфекционного перитонита кошек у кошек с низкой клинической предсказуемостью заболевания (Paltrinieri et al., 2007).

 

Giori et al. (2011) исследовали специфичность и чувствительность различных тестов у 12 кошек, у 4 из которых было подтверждено отсутствие FIP при помощи гистопатологии и иммуногистохимии, и 8 кошек с подтвержденным при помощи гистопатологии и иммуногистохимии FIP. Результаты данных электрофореза белков сыворотки, анализов выпотов, серологических исследований антител против коронавироза кошек, сывороточных концентраций AGP и гистопатологии затем были сравнены с подтвержденным диагнозом.

 

Не было обнаружено соответствия для серологического исследования и анализов выпотов, плохое соответствие было найдено для гистопатологии, среднее соответствие было найдено для сывороточного электрофореза и отличное соответствие было найдено для AGP. Было сделано заключение, что иммуногистохимическое исследование должно всегда выполняться для подтверждения инфекционного перитонита кошек и, если это невозможно и гистопатологии не дала окончательный диагноз, увеличенные концентрации AGP могут поддерживать диагноз FIP. Тем не менее, малое количество кошек в этом исследовании делают трудным оценку таких заключений и более раннее исследование Paltrinieri et al. (2007), вероятно, более точно оценивало AGP тестирование на FIP. Как и для большинства непрямых тестов на FIP, позитивная прогностическая оценка увеличивается с увеличением других имеющихся факторов риска.

 

Paltrinieri et al. (2012) также исследовали уровни   AGP, связанной с лейкоцитами у нормальных кошек и коше с заболеваниями, включая инфекционный перитонит кошек,, при помощи проточной цитометрии. Были исследованы 32 здоровые кошки (19 серопозитивны на коронавирус), 13 кошек с FIP (предположительно все серопозитивные на коронавирус) и 12 кошек с другими заболеваниями (6 позитивны на коронавирус). Были сравнены пропорция кошек с   AGP-положительными лейкоцитами в каждой группе или у кошек с различной степенью выраженности воспалительного ответа (что определялось общим анализом крови, сывороточным электрофорезом и сывороточными уровнями AGP). AGP- положительные лейкоциты были найдены у 23% кошек; большинство из них были больны, но небольшое количество их были здоровыми. AGP-положительно окрашивание лейкоцитов было ассоциировано с воспалением, а не с лейкоцитозом, как таковым. Окрашивание среди здоровых кошек не было связано с наличием коронавирусных антител. Кошки с FIP   с большей вероятностью имели положительное окрашивание лейкоцитов, чем здоровые кошки, но не чаще, чем кошки с другими заболеваниями. Было сделано заключение, что AGP -положительные лейкоциты присутствуют в крови кошек, особенно во время воспаления. Окрашивание лейкоцитов, связанных с AGP, не имеет какого-либо преимушества, в сравнении с AGP -тестированием сыворотки, особенно, когда рассматриваются потенциальные затраты и усилия для выполнения этого метода.

 

Посмертные и гистопатологические результаты

 

  Хотя исследования, такие как выполненные Giori et al. (2011), преувеличивали достоверность гистопатологического исследования, макроскопические и гистологические поражения при FIP стеретипны. Тщательная некропсия с адекватным гистопатологическим исследованием патологически измененных тканей может быть точным способом подтверждения диагноза. Однако, как и для других аспектов этого заболевания, ветеринарные патологи часто затрудняются поставить окончательный диагноз кошкам с FIP на основании того, что они видят макро и и микроскопически, даже если они часто делают это при неоплазии. Имеется тенденция описать то, что найдено и указать инфекционный перитонит кошек в качестве наиболее вероятной причины. Это затем приводит к необходимости выполнения иммуногистохимического исследования, так, что окончательный диагноз может быть сделан, но окончательный диагноз, при этом, ставится не во всех случаях.

 

Тест Ривальта

 

Тест Ривальта очень популярен, особенно в Европе, и в течение длительного времени используется для диагностирования инфекционного перитонита кошек с использованием экссудата (Hartmann et al., 2003). Тест заключается в размещении нескольких капель асцитической или жидкости из грудной полости в пробирку, содержащую слабый раствор уксусной кислоты. При положительном тесте наблюдается появление белых хлопьев. Положительный тест Ривальта ранее считался высокоспецифичным для жидкостей, появляющихся при FIP. В исследовании с 497 кошками с выпотами, 35% которых имели подтвержденный инфекционный перитонит кошек, тест Ривальта имел чувствительность 91% и специфичность 66% с положительной прогностичекой ценностью 58% и негативной прогностической ценностью 93% ( Fischer et al., 2012). Как и ожидалось, эти оценки увеличивались, когда из исследования были исключены кошки с лимфосаркомой или бактериальной инфекцией, или когда рассматривались только кошки ≥ 2 лет возраста. Тест Ривальта был воспроизводим в образцах, хранимых в течение 21 день при комнатной температуре, охлаждении или замораживании и при некоторых модификациях концентрации кислоты ( Fischer et al., 2013). Однако, оценка этого теста является субьективной и результаты, поэтому, в какой то степени, зависят от специалиста, оценивающего тест.

Обратная транскриптаза- PCR в реальном времени для диагностики кишечного коронавируса кошек в фекалиях

Некоторые заводчики кошек будут тестировать образцы кала на FECV по различным причинам, включая диагностику инфекционного перитонита кошек или выявление определенных кошек, которые являются источником появления проблем с FIP. Хотя кошки с FIP часто выделяют FECV, это выделение непостоянно и вирус выделяется в более низких количествах, чем у здоровых кошек; коронавирус кошек в этих случаях обычно кищечный, а не FIP биотип (Pedersen, N.C., Liu, H., Scarlett, J., Leutenegger, C.M., Golovko, L., Kennedy, H., Kamal, F.M., 2012 and Pedersen, N.C., Liu, H., Dodd, K.A., Pesavento, P.A., 2009; Chang et al., 2010 and Chang, H.W., Egberink, H., Halpin, R., Spiro, D.J., Rottier, P.J., 2012).Это применение теста будет обескураживающим, поскольку шансы того, что значительная часть кошек в питомнике будет выделять FECV в настоящее время высоки, в то время как шансы развития инфекционного перитонита кошек у взрослого животного, выделяющего FECV, очень низкие.

Существуют доказательства, однако, что более высокая пропорция кошек в питомнике, выделяющих коронавирус в данное время, и более высокий уровень выделения указывают на большую вероятность появления  инфекционного перитонита кошек в популяции (Foley et al., 1997). Тестирование фекалий на коронавироз кошек RT-PCR в реальном времени является не только хорошим способом выявления выделения вируса, но также хорошим способом подсчитать уровень и частоту выделения. RT-PCR в реальном времени коммерчески доступна и имеет высокую точность, при условии правильного выполнения. Однако,  необходимо брать во внимание наличие ингибиторов, это может повлиять на количественные измерения уровней выделения вируса (Dye et al., 2008). Большое количество вируса выделяется с фекалиями в течение многих недель, и даже месяцев, после первоначального инфицирования, но со временем и при отсутствии повторного инфицирования у большинства кошек выделение вируса будет прекращаться (Pedersen et al., 2008).Однако, некоторые кошки выделяют вирус в высоких уровнях в течение длительного периода времени и некоторые кошки, у которых прекращается выделение, становятся чувствительными к повторной инфекции (Pedersen et al., 2008)

 

FECV является наиболее часто встречающимся в большой и разнообразной группе энтеропатогенов, выявляемых в фекалиях от кошек с диареей и здоровых кошек из приютов и            является единственным энтеропатогеном, который имел слабую статистическую ассоциацию с диареей (Sabashin et al., 2012). ). Поэтому, симптомы нарушения пищеварения нечасты и обычно слабо выражены и кратковременны (Pedersen et al., 2008). Учитывая тот факт, что большинство кошек из питомников или приютов выделяют вирус в любое данное время, вместе с его низким  потенциалом для собственного заболевания, малоцелесообразно тестировать на его наличие в приютах или питомниках, за исключением необходимости устранения FECV из помещений и, тем самым, снизить шансы на смерть кошек от инфекционного перитонита кошек.

 

Однако, без содержания кошек и, особенно, котят в низких количествах и не соблюдая крайне строгий карантин,  FECV трудно удалить из помещений и легко повторно приобрести. Кроме того, устранение FECV  и поддержание  в таком состоянии противоречит цели таких организаций. Даже если достигается статус отсутствия этой инфекции, котята из такого окружения будут, в конечном итоге,  вступать в контакт с вирусом, когда они отправятся в другие места или  в питомник будут введены новые кошки. Хотя тестирование фекалий на FECV не очень продуктивная процедура, существует некоторая прогностическая ценность в знании пропорции и частоты выделения вируса  животными, выделяющими вирус. Чем выше пропорция и частота выделения, тем более вероятно появление инфекционного перитонита кошек  (Foley et al., 1997).

 

Выделение FECV может также быть косвенно измерено серологическими тестами. Уровни сывороточных антител к коронавирусу кошек, измеренные непрямым иммунофлуоресцентным методом, на протяжении 2 недель инфекции составляли от 1:100 до 1:400, а затем падали до 1:25 или ниже у кошек, у которых развивался иммунитет и прекращалось выделение (Pedersen et al., 2008).Серологические исследования коронавируса кошек могут также быть использованы как непрямое измерение выделения FECV. Кошки, имеющие титры антител от 1:100 до 1:400 или выше, обычно выделяют FECV, а кошки с титрами 1:25 или ниже обычно не выделяют вирус. Однако, некоторые кошки с низкими или отрицательными уровнями антител в сыворотке или выпотах могут пока содержать значительное количество вируса в их фекалиях или выпотах.

 

Прямые тесты

 

Хотя автор считает, что диагноз инфекционный перитонит кошек может быть сделан с достаточной определенностью на основании данных по возрасту, полу, породе, симптомам заболевания, физикальному обследованию и результатов непрямых тестов, мрачные последствия диагноза часто заставляют владельцев и ветеринаров искать окончательный диагноз. Окончательный диагноз на инфекционный перитонит кошек требует идентификации вирусной РНК или белков в макрофагах в характерных поражениях или жидкостях из пораженных тканей. В настоящее время имеется 2 типа тестов, предназначенных для постановки окончательного диагноза: (1) идентификация вирусных протеинов при помощи иммуногистохимического исследования, и (2) идентификации вирусной РНК некоторыми видами тестов, основанных на PCR.

 

Тесты, основанные на PCR

 

Тесты, основанные на PCR, используются для диагностирования инфекционного перитонита кошек почти 20 лет. (Li and Scott, 1994). В PCR-основанных тестах на коронавирус кошек сначала очищается РНК из фекалий, крови или тканей; РНК затем   проводится обратимая транскрипция с комплементарной ДНК. Небольшая часть этой комплементарной ДНК, которая кодирует специфическую для коронавируса кошек последовательность, затем усиливается в тысячи раз и продукт идентифицируется как единичная отчетливая группа методом электрофореза в геле. Дальнейшие уточнения делаются для увеличения чувствительности и специфичности PCR. Гнездовая PCR является методом, который сильно увеличивает способность теста выявлять очень маленькие количества РНК коронавируса кошек, такж как комплементарного ДНК ( Gamble et al., 1997). Гнездовая PCR, по сообщениям, имеет > 90% чувствительность и специфичность в выявлении FIPV в асцитической жидкости от кошек с выпотным FIP (Gamble et al., 1997). Хотя она очень чувствительная, гнездовая PCR доставляет беспокойства контаминацией ДНК продуктов PCR, что вызывает ложноположительные реакции.

 

Проблему лабораторной контаминации PCR продуктами можно избежать использованием RT-PCR в реальном времени и, по этой причине, практически все диагностические тесты, основанные на PCR для выявления РНК FECV/FIPV, основываются на этом формате. В основном, всеми признано, что RT-PCR в реальном времени является довольно чувствительным и специфичным методом в выявлении и полуколичественном определении выделения коронавируса кошек(FECV) как в экспериментальных условиях, так и у естественно инфицированных кошек (Pedersen, N.C., Liu, H., Scarlett, J., Leutenegger, C.M., Golovko, L., Kennedy, H., Kamal, F.M., 2012, Pedersen, N.C., Liu, H., Dodd, K.A., Pesavento, P.A., 2009 and Pedersen et al., 2008; Kipar et al., 2010; Vogel et al., 2010; An et al., 2011; Addie et al., 2012; Amer et al., 2012; Wang et al., 2013). Однако высокая чувствительность и специфичность зависит от множества переменных. Образцы должны быть собраны так, чтобы максимизировать содержание вируса, вирусная РНК в пределах этих образцов должна быть соответствующим образом извлечена и сохранена, РНК должна быть соответствующим образом очищена и подвергнута обратимой транскрипции, любые PCR ингибиторы (обычно в фекалиях) должны быть устранены (Dye et al., 2008), все реагенты должны быть соответствующим образом рассчитаны и должны поддерживаться в активной форме, и с образцами должны работать компетентные технические специалисты на надежном оборудовании.

 

Остающейся проблемой является высокая степень разнообразия вирусного генома, что нарушает связывание праймеров, используемых в RT-PCR тестах. Была сделана попытка устранить эту проблему созданием RT-PCR, которая учитывает степень геномной вариабельности различных кошачьих коронавирусов (Hornyák et al., 2012) Большинство этих технических аспектов, хотя это и сложно, можно преодолеть. Поэтому, обычно предполагается, что метод RT-PCR в реальном времени является чувствительным способом выявления РНК в фекалиях и пораженнных тканях/ выпоте. Тем не менее, в одном исследовании, тестировавшем его точность, было обнаружено, что тестирование, основанное на PCR, дает только 80-90% точности в подтверждении наличия FIPV в пораженных тканях (Sharif et al., 2010).

 

 Хотя RT-PCR в реальном времени может быть очень точным в определении FECV в фекалиях и FIPV в патологически измененных тканях и жидкостях, окончательным тестом является тот, который выявляет FIPV в крови. Проблема дифференциации РНК FECV от РНК FIPV существует достаточно давно (Herrewegh et al., 1995) и, на основании теории о том, что FECV обнаруживаются   только в тонком кишечнике и не реплицируются в тканях, тест создан для того, что бы обнаружить только репликацию  РНК коронавируса кошек  (т. е. субгеномную РНК); данный тест претендовал на то, чтобы правильно диагностировать 93% кошек с подтвержденным FIP и не реагировать на наличие других заболеваний (Simons et al., 2005). Однако, во втором исследовании, использовавшем ту же самую процедуру, 54% здоровых кошек, особенно в возрасте 6-12 месяцев, также давали положительную реакцию  (Can-Sahna et al., 2007). Это позднее было обьяснено экспериментальными исследованиями инфекции FECV Kipar et al. (2010) и Vogel et al. (2010), которые оба продемонстрировали, что виремия сочетается с кишечной инфекцией. FECV была выявлена в моноцитах/макрофагах крови у 40% экспериментально инфицированных FECV кошек к 14 дню и 14% кошек сохраняли виремию к 48 дню после инфицирования; FECV была выявлена в нескольких внутренних органах, после того, как выделение вируса с калом прекращалось (Kipar et al., 2010).

 

Проблема сочетанной FECV инфекции может быть преодолена путем разработки тестов, которые выявляют FIPV- уникальные мутации. Мутации генов  ORF 3c  и  S1/S2 являются уникальными для каждого FIPV и, поэтому, являются плохими кандидатами. Наиболее специфичными для   FIPV мутациями являются 2 единичных нуклеотидных изменения в пределах поверхностного  (S) белка  (Chang et al., 2010). Обе эти мутации наблюдаются у > 98% FIPV, выявленных  в пораженных тканях, но нет сообщений о результатах относительно того, присутствуют ли эти мутации в крови в определяемых уровнях. Возможно также, что эти мутации могут быть найдены у здоровых кошек с абортивной или субклинической формой инфекции. Даже если будут разработаны очень чувствительные и специфичные тесты для выявления  РНК FIPV, оказалось, что, многие кошки с естественно встречающимся FIP не имеют выявляемых уровней вирусного РНК в их крови, также как в плазме или в концентрированной фракции белых клеток крови

 

Методы иммунноокрашивания

 

  Иммуноокрашивание патологически измененный тканей (иммуногистохимия) или жидкостей при помощи иммунофлуоресцентного или иммунопероксидазного методов может быть также надежно, как RT-PCR, но точность этих методов ограничена качеством  используемых реагентов, используемыми образцами тканей и  квалицикацией патолога определении  истинного положительного окрашивания в пределах макрофагов образцов тканей или выпотов. Иммунофлуоресцентный метод более чувствительный, чем иммуноппероксидазный, но требует замороженных срезов (с или без глицерол/резин защитной среды), в то время как иммунооксипероксидазное окрашивание может быть выполненов в фиксированных формалином тканях. Фиксация в формалине должна быть завершена как можно быстрее после забора тканей. Хотя иммуногистохимия рассматривается как точный метод для постановки окончательного диагноза инфекционный перитонит кошек (Giori et al., 2011), имеются случаи инфекционного перитонита кошек, которые дают негативный результат теста, в зависимости от качества ткани, наличия адекватных поражений в исследуемом материале и качества реагентов.

 

Иммуногистохимия выпотов или жидкостей от кошек, подозреваемыъ в наличии инфекционного перитонита кошек, должна использоваться значительно чаще, чем в настояшее время. Выпоты часто содержат   значительные количества содержащих вирус макрофагов, которые могут быть сконцентрированы в слайдах. Эта техника также успешно используется для выявления FIPV- инфицированных макрофагов в спинномозговой жидкости  кошек с неврологическими заболеваниями (Ives et al., 2013). Неспецифическое положительное окрашивание макрофагов также может быть проблемой.  Litster et al. (2013) сравнивал результаты прямого имуунофлуоресцентного окрашивания  выпотов кошек при прижизненном исследовании с посмертными результатами у 17 кошек с абдоминальными или торакальными выпотами. Гистологическое исследование тканей, собранных во время некропсии,  подтвердило наличие FIP в  10/17 случаях и исключило  инфекционный перитонит кошек  в 7/17случаев. Прижизненное прямое иммунофлуоресцентное тестирование было положительно во всех 10 случаях инфекционного перитонита кошек, подтвержденного  при посмертном исследовании. В 7 случаях, когда инфекционный перитонит кошек был исключен при посмертном исследовании, прямое иммунофлуоресцентное исследование было негативным в 5 случаях и положительным в 2 оставшихся случаях. Подсчитанная чувствительность иммуногистохимии была 100%, а специфичность 71,4%. Дубликаты образцов выпотов от 8 кошек, которые были первоначально положительными при выполнении иммунофлуоресценции, хранились в при температуре 4 °C или комнатной температуре (22-25 °C) и подвергались сериальному тестированию для определения продолжительности сохранения положительных результатов. Образцы, положительные   при прямом иммунофлуоресцентном окрашивании, хранившиеся при обоих вариантах температур, сохраняли положительный статус в течение, как минимум 2 дней.

Иммунопероксидазное окрашивание использовалось для диагностики FIPV в макрофагах кожи 2 кошек с атипичными поражениями кожи (множественные папулярные поражения; Declercq et al., 2008; Bauer et al., 2013) и в различных тканях больной пумы (Stephenson et al., 2013)

Статьи по теме:

 



Источник: veter96.ru


Добавить комментарий